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\u00a9 Interpharma<\/figcaption><\/figure>\n\n\n\n
Les chercheurs ont besoin de quelques moyens auxiliaires parmi lesquels les enzymes de restriction, outil indispensable au clonage. Ces enzymes sont comparables aux chiens de garde: dans la nature, ils prot\u00e8gent les bact\u00e9ries de l’ADN \u00e9tranger au moment o\u00f9 les virus transf\u00e8rent leur patrimoine g\u00e9n\u00e9tique dans la bact\u00e9rie. Les enzymes de restriction reconnaissent l’ADN \u00e9tranger et le mettent en morceaux par un proc\u00e9d\u00e9 appel\u00e9 restriction. Les enzymes de restriction peuvent diff\u00e9rencier leur propre ADN de l’ADN \u00e9tranger puisque leur propre ADN est marqu\u00e9: ils sont dot\u00e9s d’une mol\u00e9cule chimique (un groupe m\u00e9thyle) \u00e0 des endroits pr\u00e9cis comme s’il s’agissait d’un drapeau. L’ADN \u00e9tranger par contre ne porte pas de drapeau.<\/p>\n\n\n\n
Les enzymes de restriction travaillent de mani\u00e8re tr\u00e8s pointue: ils reconnaissent les courtes s\u00e9quences d’ADN puis coupent le brin. Un enzyme de restriction extr\u00eamement utilis\u00e9 par les chercheurs s’appelle Eco RI, il s’agit du premier enzyme de restriction d\u00e9tect\u00e9 dans la bact\u00e9rie Escherichia coli<\/em> (E.coli<\/em>). Il reconnait et coupe la s\u00e9quence GAATTC en laissant des \u00abbouts collants\u00bb (\u00absticky end\u00bb) (cf. la s\u00e9quence du film \u00abRecombinant DNA Technology\u00bb). De cette mani\u00e8re, les fragments d’ADN ainsi obtenus peuvent \u00e0 nouveau \u00eatre reli\u00e9s l’un \u00e0 l’autre et ce, relativement facilement (voir illustration 2.1).<\/p>\n\n\n\n Pour effectuer un clonage, on utilise non seulement des enzymes de restriction mais \u00e9galement des plasmides. Les plasmides sont des \u00abtaxis g\u00e9niques\u00bb, ils peuvent assimiler l’ADN \u00e9tranger et l’introduire dans une bact\u00e9rie. Des bact\u00e9ries telles que les bact\u00e9ries E. coli se chargent alors de la production des g\u00e8nes et des prot\u00e9ines. Les bact\u00e9ries E. coli <\/em>sont les organismes les plus utilis\u00e9s par la plupart des laboratoires de recherche, ce sont les organismes les mieux \u00e9tudi\u00e9s scientifiquement.<\/p>\n\n\n\n Les chercheurs utilisent une \u00abastuce\u00bb pour que le clonage fonctionne. Les plasmides utilis\u00e9s peuvent non seulement assimiler l’ADN mais de plus, ils poss\u00e8dent un g\u00e8ne qui conf\u00e8re aux bact\u00e9ries ayant assimil\u00e9 un plasmide une r\u00e9sistance envers l’antibiotique ampicilline. Les antibiotiques sont les m\u00e9dicaments les plus efficaces pour tuer les bact\u00e9ries.<\/p>\n\n\n\n Dans notre exp\u00e9rimentation, les enzymes de restriction Eco RI d\u00e9coupent l’ADN humain r\u00e9colt\u00e9 sur notre \u00e9chantillon de salive. Des milliers de fragments d\u2019ADN se forment alors d’ADN- un seul contient le g\u00e8ne insuline recherch\u00e9. Nous coupons \u00e9galement les plasmides bact\u00e9riens \u00e0 l’aide des m\u00eames enzymes. Gr\u00e2ce aux \u00abbouts collants\u00bb, nous pouvons remettre bout \u00e0 bout les diff\u00e9rents fragments. De nombreux plasmides n’assimilent rien, beaucoup d’autres l’ADN humain et quelques-uns seulement le g\u00e8ne insuline recherch\u00e9. Les plasmides seront alors infiltr\u00e9s dans les bact\u00e9ries E. coli<\/em>.<\/p>\n\n\n\n Toutes les bact\u00e9ries seront ensuite r\u00e9parties sur des plaques contenant un milieu de culture ainsi que l’antibiotique ampicilline qui inhibe la croissance des bact\u00e9ries. Par cette \u00e9tape, on va s\u00e9parer le bon grain de l’ivraie; toutes les bact\u00e9ries ayant assimil\u00e9 un plasmide peuvent pousser sur la plaque et former une colonie puisque le plasmide les a rendues r\u00e9sistantes \u00e0 l’ampicilline. Les bact\u00e9ries se reproduisent et par l\u00e0 m\u00eame, la s\u00e9quence du g\u00e8ne insuline d\u00e9sir\u00e9. A ce stade, nous avons clon\u00e9 par g\u00e9nie g\u00e9n\u00e9tique mille fragments d’ADN humain et pas seulement ceux qui nous int\u00e9ressent. L’\u00e9tape suivante, l’\u00e9chantillonnage de toutes les colonies \u00e9galement appel\u00e9 \u00abscreening\u00bb sera donc d’envergure.<\/p>\n\n\n\n Comment trouver le clone portant le g\u00e8ne insuline parmi ces milliers de clones? Une partie de la s\u00e9quence d’ADN du g\u00e8ne insuline \u00e9tant d\u00e9j\u00e0 connue, on pourra produire un fragment d’ARNm long d’environ 30 paires de bases qui va se fixer \u00e0 la s\u00e9quence du g\u00e8ne insuline. Cette sonde sera marqu\u00e9e par radioactivit\u00e9 ou par fluorescence permettant ainsi de retrouver les clones sur lesquels elle s’est fix\u00e9e. Cette sonde va donc permettre de trouver le clone contenant le g\u00e8ne insuline (voir illustration 2.2). C’est ainsi que bien des g\u00e8nes furent clon\u00e9s, non seulement le g\u00e8ne de l’insuline mais \u00e9galement celui de l’hormone de croissance et de l’interf\u00e9ron utilis\u00e9s \u00e9galement en tant que m\u00e9dicaments.<\/p>\n\n\n\n Le clonage g\u00e9n\u00e9tique s’est achev\u00e9 avec succ\u00e8s; on comprend donc ais\u00e9ment pourquoi l’on utilise des bact\u00e9ries et non des organismes sup\u00e9rieurs: les organismes sup\u00e9rieurs se reproduisent sexuellement. La sexualit\u00e9 est un avantage pour ces \u00eatres vivants puisque le patrimoine g\u00e9n\u00e9tique peut \u00eatre recombin\u00e9: il en r\u00e9sulte de nouveaux individus ayant de nouvelles caract\u00e9ristiques. Il en ressort des avantages pour l’\u00e9volution de la recherche; mais pour les chercheurs eux-m\u00eames, une recombinaison g\u00e9n\u00e9tique sous cette forme devient g\u00eanante car on pourrait assister \u00e0 une modification du g\u00e8ne, le g\u00e8ne insuline dans notre exemple.<\/p>\n\n\n\n Les chercheurs doivent travailler avec des animaux g\u00e9n\u00e9tiquement identiques; seuls les clones r\u00e9agissent toujours de la m\u00eame mani\u00e8re lors d’exp\u00e9rimentation. Pour tester un m\u00e9dicament, les chercheurs vont toujours utiliser des souris de m\u00eame souche. Celles-ci seront cultiv\u00e9es par consanguinit\u00e9 ou par croisement d’animaux tr\u00e8s proches.<\/p>\n\n\n\n![\"\"](\"http:\/\/biotechlerncenter.interpharma.ch\/wp-content\/uploads\/sites\/4\/2020\/01\/istock_xgal_900.jpg\")
\u00a9 istockphoto<\/figcaption><\/figure>\n\n\n\n![\"\"](\"https:\/\/biotechlerncenter.interpharma.ch\/wp-content\/uploads\/sites\/4\/2020\/02\/grafik2-2_fr-355x1024.jpg\")
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