4. Les moyens auxiliaires au clonage

Les chercheurs ont besoin de quelques moyens auxiliaires parmi lesquels les enzymes de restriction, outil indispensable au clonage. Ces enzymes sont comparables aux chiens de garde: dans la nature, ils protègent les bactéries de l'ADN étranger au moment où les virus transfèrent leur patrimoine génétique dans la bactérie. Les enzymes de restriction reconnaissent l'ADN étranger et le mettent en morceaux par un procédé appelé restriction. Les enzymes de restriction peuvent différencier leur propre ADN de l'ADN étranger puisque leur propre ADN est marqué: ils sont dotés d'une molécule chimique (un groupe méthyle) à des endroits précis comme s'il s'agissait d'un drapeau. L'ADN étranger par contre ne porte pas de drapeau.

Les enzymes de restriction travaillent de manière très pointue: ils reconnaissent les courtes séquences d'ADN puis coupent le brin. Un enzyme de restriction extrêmement utilisé par les chercheurs s'appelle Eco RI, il s'agit du premier enzyme de restriction détecté dans la bactérie Escherichia coli (E.coli). Il reconnait et coupe la séquence GAATTC en laissant des «bouts collants» («sticky end») (cf. la séquence du film «Recombinant DNA Technology»). De cette manière, les fragments d'ADN ainsi obtenus peuvent à nouveau être reliés l'un à l'autre et ce, relativement facilement (voir illustration 2.1).

Pour effectuer un clonage, on utilise non seulement des enzymes de restriction mais également des plasmides. Les plasmides sont des «taxis géniques», ils peuvent assimiler l'ADN étranger et l'introduire dans une bactérie. Des bactéries telles que les bactéries E. coli se chargent alors de la production des gènes et des protéines. Les bactéries E. coli sont les organismes les plus utilisés par la plupart des laboratoires de recherche, ce sont les organismes les mieux étudiés scientifiquement.

Les chercheurs utilisent une «astuce» pour que le clonage fonctionne. Les plasmides utilisés peuvent non seulement assimiler l'ADN mais de plus, ils possèdent un gène qui confère aux bactéries ayant assimilé un plasmide une résistance envers l'antibiotique ampicilline. Les antibiotiques sont les médicaments les plus efficaces pour tuer les bactéries.

Dans notre expérimentation, les enzymes de restriction Eco RI découpent l'ADN humain récolté sur notre échantillon de salive. Des milliers de fragments d’ADN se forment alors d'ADN- un seul contient le gène insuline recherché. Nous coupons également les plasmides bactériens à l'aide des mêmes enzymes. Grâce aux «bouts collants», nous pouvons remettre bout à bout les différents fragments. De nombreux plasmides n'assimilent rien, beaucoup d'autres l'ADN humain et quelques-uns seulement le gène insuline recherché. Les plasmides seront alors infiltrés dans les bactéries E. coli.

Toutes les bactéries seront ensuite réparties sur des plaques contenant un milieu de culture ainsi que l'antibiotique ampicilline qui inhibe la croissance des bactéries. Par cette étape, on va séparer le bon grain de l'ivraie; toutes les bactéries ayant assimilé un plasmide peuvent pousser sur la plaque et former une colonie puisque le plasmide les a rendues résistantes à l'ampicilline. Les bactéries se reproduisent et par là même, la séquence du gène insuline désiré. A ce stade, nous avons cloné par génie génétique mille fragments d'ADN humain et pas seulement ceux qui nous intéressent. L'étape suivante, l'échantillonnage de toutes les colonies également appelé «screening» sera donc d'envergure.

Comment trouver le clone portant le gène insuline parmi ces milliers de clones? Une partie de la séquence d'ADN du gène insuline étant déjà connue, on pourra produire un fragment d'ARNm long d'environ 30 paires de bases qui va se fixer à la séquence du gène insuline. Cette sonde sera marquée par radioactivité ou par fluorescence permettant ainsi de retrouver les clones sur lesquels elle s'est fixée. Cette sonde va donc permettre de trouver le clone contenant le gène insuline (voir illustration 2.2). C'est ainsi que bien des gènes furent clonés, non seulement le gène de l'insuline mais également celui de l'hormone de croissance et de l'interféron utilisés également en tant que médicaments.

Le clonage génétique s'est achevé avec succès; on comprend donc aisément pourquoi l'on utilise des bactéries et non des organismes supérieurs: les organismes supérieurs se reproduisent sexuellement. La sexualité est un avantage pour ces êtres vivants puisque le patrimoine génétique peut être recombiné: il en résulte de nouveaux individus ayant de nouvelles caractéristiques. Il en ressort des avantages pour l'évolution de la recherche; mais pour les chercheurs eux-mêmes, une recombinaison génétique sous cette forme devient gênante car on pourrait assister à une modification du gène, le gène insuline dans notre exemple.

Les chercheurs doivent travailler avec des animaux génétiquement identiques; seuls les clones réagissent toujours de la même manière lors d'expérimentation. Pour tester un médicament, les chercheurs vont toujours utiliser des souris de même souche. Celles-ci seront cultivées par consanguinité ou par croisement d'animaux très proches.

Introduction d'un morceau d'ADN dans un plasmide à l'aide d'un enzyme de restriction et d'une ligase.

Introduction d'un morceau d'ADN dans un plasmide à l'aide d'un enzyme de restriction et d'une ligase.
BTLC Klonieren Grafik 2.1 Restriktionsenzyms_fr
Illustration 2.1: Mode de fonctionnement d'un enzyme de restriction
© Interpharma
BTLC Klonieren Grafik 2.2 Prinzip der Klonierung eines Gens_fr
Illustration 2.2: Principe du clonage d'un gène de cellules de mammifére
© Interpharma
BTLC Klonieren Blaue Bakterien_fr
Colonies de bactéries en bleu sur une plaque.
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