4. Die Hilfsmittel der Genklonierung

Forschende bedienen sich verschiedener Hilfsmittel. Ein unentbehrliches Klonierungs-Hilfsmittel sind so genannte Restriktionsenzyme. Diese Enzyme sind vergleichbar mit Wachhunden: In der Natur schützen sie Bakterien vor fremder DNA, etwa wenn Viren ihr Erbgut in das Bakterium übertragen. Dann erkennen Restriktionsenzyme die fremde DNA und zerstückeln sie in einem Vorgang, den man als Restriktion bezeichnet. Restriktionsenzyme können zwischen eigener und fremder DNA unterscheiden, denn die eigene DNA ist markiert, das heisst, sie ist an bestimmten Stellen mit einem chemischen Molekül versehen (Methylgruppe), welche wie eine Fahne funktioniert. Fremde DNA hingegen trägt diese Fahne nicht.

Restriktionsenzyme arbeiten äusserst spezifisch: Sie erkennen kurze DNA-Sequenzen und schneiden den Faden. Ein von Forschenden in Experimenten oft verwendetes Restriktionsenzym heisst Eco RI, das erste beim Bakterium Escherichia coli (E. coli) entdeckte Restriktionsenzym. Es erkennt und schneidet die Sequenz GAATTC, wobei es sogenannte klebrige Enden («sticky ends») hinterlässt (siehe Filmsequenz «Recombinant DNA Technology»). Auf diese Weise entstandene DNA-Stücke (Fragmente) können relativ einfach wieder untereinander verknüpft werden  (siehe Grafik 2.1).

Neben den Restriktionsenzymen sind Plasmide ein weiteres Hilfsmittel für eine Klonierung. Plasmide sind «Gen-Taxis»: Sie können fremde DNA aufnehmen und in Bakterien überführen. Bakterien, zum Beispiel so genannte E. coli-Bakterien, übernehmen dann die Produktion der Gene und Proteine. E. coli-Bakterien sind die Hauptversuchsorganismen sehr vieler Forschungslabors, sie sind das naturwissenschaftlich bestuntersuchte Lebewesen.

Damit die Klonierung funktioniert, brauchen Forschende einen Trick: Die verwendeten Plasmide können nicht nur DNA aufnehmen, sie besitzen zusätzlich ein Gen, das den Bakterien, welche das Plamid aufnehmen, eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Ampicillin verleiht. Antibiotika sind die effizientesten Arzneien, um Bakterien abzutöten.

Die Restriktionsenzyme Eco RI zerschneiden in unserem Versuch die menschliche DNA, die wir aus der Speichelprobe gewonnen haben. Dadurch entstehen tausende DNA-Stücke - eines davon enthält das gesuchte Insulin-Gen. Mit den gleichen Enzymen zerschneiden wir auch die bakteriellen Plasmide. Aufgrund der klebrigen Enden können wir die einzelnen Stücke wieder zusammenführen. Viele Plasmide werden nichts aufnehmen, viele nehmen menschliche DNA auf und wenige werden das gesuchte Insulin-Gen aufnehmen. Die Plasmide werden dann in E. coli-Bakterien eingeschleust.

Nun verteilen wir alle Bakterien auf einer Platte mit Nährmedium, auf dem Bakterien prinzipiell aber nicht wachsen können, weil die Platten das Antibiotikum Ampicillin enthalten. Mit diesem Schritt teilt sich die Spreu vom Weizen: Alle Bakterien, welche ein Plasmid aufgenommen haben, können auf der Platte wachsen und eine Kolonie bilden, da das Plasmid sie resistent macht gegenüber Ampicillin. Die Bakterien vervielfältigen sich und dabei auch die gewünschte Insulin-Gensequenz.

An diesem Punkt haben wir durch die Klonierung tausende von menschlichen DNA-Stücken kloniert und nicht nur solche, die uns interessieren. Der nächste Schritt, die Durchmusterung aller Kolonien, auch «screening» genannt, ist sehr aufwändig.

Wie können wir aus all den tausend Klonen denjenigen finden, der unser Insulin-Gen trägt? Wenn wir bereits einen Teil der DNA-Sequenz des Insulin-Gens kennen, dann können wir ein etwa 30 Basenpaare langes mRNA-Stück herstellen, welches an die Insulin-Gensequenz andocken wird. Diese Sonde ist markiert, zum Beispiel radioaktiv oder mit Fluoreszenz, damit wir feststellen können, bei welchen Klonen sie andockt. Dank dieser Sonde finden wir jenen Klon, der unser Insulin-Gen enthält (siehe Grafik 2.2). Auf diese Weise wurden neben Insulin viele weitere Gene geklont, zum Beispiel für Wachstumshormone und Interferon, welche ebenfalls als Medikamente eingesetzt werden.

Damit ist die Genklonierung erfolgreich abgeschlossen und es wird ersichtlich, warum dazu Bakterien verwendet werden und keine höheren Organismen: Höhere Organismen pflanzen sich sexuell fort. Sexualität hat für diese Lebewesen den Vorteil, dass das Erbgut neu kombiniert werden kann und dass daraus neue Individuen mit neuen Eigenschaften entstehen können. Das schafft in der Evolution Vorteile, für Forscherinnen und Forscher ist diese genetische Neukombination aber störend, denn bei dieser Neukombination könnte auch das Insulin-Gen verändert werden.

Forschende müssen mit Tieren arbeiten, die genetisch identisch sind: nur Klone reagieren in einem Experiment immer auf die gleiche Weise. Möchten Forscherinnen und Forscher zum Beispiel ein Medikament testen, so verwenden sie stets Mäuse des gleichen Stamms. Solche Mäusestämme werden mit Hilfe von Inzucht gezüchtet oder es werden dazu eng verwandte Tiere miteinander gekreuzt.
 

Einfügen eines Stücks DNA in ein Plasmid mit Hilfe eines Restriktionsenzyms und einer Ligase.

Einfügen eines Stücks DNA in ein Plasmid mit Hilfe eines Restriktionsenzyms und einer Ligase.
BTLC Klonieren Grafik 2.1 Restriktionsenzyms
Grafik 2.1 Funktionsweise eines Restriktionsenzyms
© Interpharma
BTLC Klonieren Grafik 2.2 Prinzip der Klonierung eines Gens
Grafik 2.2 Prinzip der Klonierung eines Gens aus Säugerzellen
© Interpharma
BTLC Klonieren Blaue Bakterien
Blaue Bakterienkolonien auf einer Platte.
© istockphoto